Авторефераты» Медицинские науки » Инфекционные болезни » Особенности течения хронического гепатита С при полиморфизме гена гемохроматоза

Особенности течения хронического гепатита С при полиморфизме гена гемохроматоза

Турский А.Ф. Особенности течения хронического гепатита С при полиморфизме гена гемохроматоза.– Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.13 – инфекционные болезни. – ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского АМН Украины», Киев, 2010.

В диссертационной работе представлены клинико-патогенетические особенности течения ХГС у 101 больного  с 1 генотипом  вируса в зависимости от наличия  или отсутствия мутантных аллелей гена гемохроматоза.

Выявлено, что у 31,68% % пациентов наблюдалось  наличие мутантных аллелей гена гемохроматоза с преобладанием «мягкой» мутации H63D.

Клиническое течение ХГС при наличии мутантных аллелей  отличалось наличием зуда, пигментации кожи, геморрагического  синдрома, гепатомегалии и сопровождалось тяжелым течением заболевания,  повышенным уровнем ГГТ, ЛДГ, α-фетопротеина, анемией, тромбоцитопенией.

Установлено, что наличие мутантных аллелей гена гемохроматоза сопровождается достоверно высокими уровнями железа и ферритина в сыворотке крови, синдром перегрузки железом выявлялся у 47,75% больных  ХГС.

Показано, что среди пациентов с наличием полиморфизма гена гемохроматоза наблюдалось большее количество больных с выраженными воспалительными изменениями в ткани печени , фиброзом и гемосидерозом. Гемосидероз III-IV ступеней регистрировался у 52,63% больных ХГС с наличием мутантных аллелей гена гемохроматоза.

Установлено при помощи логистической регрессии , что наиболее значительное влияние на риск развития ГХС имеют пол, возраст, вирусная загрузка, наличие мутацій в гене гемохроматоза.

Государственное учреждение «Институт эпидемиологии

И инфекционных болезней им.Л.В.Громашевского

АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК УКРАИНЫ »

Турского Александр Феодосиевич

УДК 616 — 0.97.616.15.576.858

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С ПРИ полиморфизма гена гемохроматоза

14.01.13 — инфекционные болезни

Работа

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Киев — 2010

Актуальность темы.

Работа выполнена в Винницком национальном медицинском университете
им. М.И. Пирогова МЗ Украины.

Научный руководитель:        доктор медицинских наук, профессор Мороз Лариса Васильевна, Винницкий национальный медицинский университет им. М.И. Пирогова МЗ Украины, заведующий кафедрой инфекционных болезней с курсом эпидемиологии, Заслуженный врач Украины.

Официальные оппоненты:

  • доктор медицинских наук, профессор Дубинская Галина Михайловна, ВДНЗУ Украины «Украинская стоматологическая медицинская академия» МЗ Украины, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии;
  • кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Боброва Ирина Анатольевна, ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней
    им. Л.В. Громашевского АМН Украины », заведующий консультативной поликлиникой.

Защита состоится «30» сентября 2010 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д.26.614.01 при ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского АМН Украины »по адресу: 01015, г.Киев, ул. И. Мазепы, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского АМН Украины »по адресу: 03038, г. Киев, ул. М. Амосова, 5.

Автореферат разослан «28» августа 2010 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук А.Л.Панасюк

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Хотя частота новых случаев инфицирования вирусом гепатита С снизилась за последние 10 лет, число HCV-инфицированных в общей попу-ляции остается значительным и оценивается ВОЗ в 170 млн. человек (Возианова Ж.И., 2005; Кулырова Б.М., 2007; Гураль А.Л., Мариевский В.Ф., 2007; Esteban Juan I. et al., 2008). Хронический гепатит С (ХГС) представляет собой медленно прогрессирующее заболевание, классификация которого базируется прежде всего на гистологической картине в ткани печени, а также на кратности повышение уровня сывороточных трансаминаз. Многообразие темпов прогрессирования ХГС связывают с влиянием на его течение многих факторов, Влияние некоторых факторов в настоящее время изучен недостаточно. Среди них много внимания стали уделять нарушением обмена железа, возможности развития синдрома перегрузки железом (СПЗ) и его влияния на прогноз ХГС.

Cпецифичною особенностью ХГС является повышение сывороточных маркеров насыщения железом и накопления этого микроэлемента в ткани печени. Так, биохимические показатели перегрузки железом оказывались у 20-40% больных ХГС, и несколько реже, у 10-30% больных, депозиты железа наблюдаются при морфологическом исследовании ткани печени (Metwally MA et al., 2004; Gandon Y. et al. , 2004). Избыточное накопление железа в ткани печени может способствовать воспалительно-деструктивному воздействию, ускорять прогрессирование заболевания до стадии цирроза и рака печени, негативно влиять на эффективность противовирусной терапии (Nichols L. et al., 2006; Davis TM et al., 2008).

Важным аспектом развития синдрома перегрузки железом при ХГС являются генетические факторы, наибольшее внимание среди которых уделяется гена гемохроматоза (НFЕ) (EASL Guidelines, 2010). Мутации НFЕ-гена C282Y и H63D ассоциированные с повышенным всасыванием железа и развитием в последующем СПЗ (Thorburn D. et al., 2002), причем повышенный уровень железа в ткани печени и наличие мутации в гене НFЕ коррелируют с тяжестью клинических проявлений и прогрессированием ХГС ( Guyader D. et al., 2007; Самоходская Л.М. и др., 2007). Таким образом, наличие мутаций в гене НFЕ при ХГС может способствовать прогрессированию фиброза печени, однако механизмы возникновения СПЗ при ХГС до сих пор остаются до конца не выясненными.

В последние годы накапливаются материалы относительно возможности применения генетических факторов или их комбинации с уже известными клиническими факторами, влияющими на темпы прогрессирования болезни, для определения течения и прогноза ХГС.Рассматривается влияние на развитие СПЗ наследственных нарушений обмена железа, связанных с полиморфизмом гена НFЕ.Существующие в настоящее время данные о распространенности мутантного аллеля гена HFE C282Y и H63D достаточно противоречиво (Nagy Z. et al., 2004; Gribier B. et al., 2009). Некоторые авторы утверждают, что частота гетерозиготного носительства мутантных аллелей у больных ХГС не превышает частоту в популяции (Щербинина С.П., 2006; Toll A. et al., 2006).

Исследованы мутации в гене HFE ассоциированные с повышенным всасыванием железа и накоплением его в организме, преимущественно в ткани печени (Dalatycki MB et al., 2005; Waalen J. et al., 2008). Считается, что в случае объединения мутации в гене HFE с HCV-инфекцией избыток железа в печени потенцирует воспалительный процесс и фиброгенез результате усиления образования свободных форм кислорода (Жданов К.В., 2007; Corengia C. et al., 2005; Missiha SB et al., 2008). В других исследованиях эти утверждения опровергаются и указывается, что гетерозиготное носительство HFE не всегда сопровождается гемосидерозом, который у больных ХГС не может быть полностью объяснен мутациями HFE (Смирнов А.А., 2008; Gan EK et al., 2010; Camaschella C. , Strati P., 2010). Некоторые авторы признают частичное влияние полиморфизма гена HFE и предполагают необходимость действия дополнительных экзогенных факторов и, возможно, наличие других генов для развития СПЗ у больных ХГС (Жданов К.В., 2009; Raszeja-Wyszomirska J. еt al., 2010; Gnana -Prakasam JP et al., 2010; Ryan JD et al., 2010). В Украине исследования относительно влияния генетических факторов на течение ХГС до последнего времени не проводились. В связи с этим дальнейшее изучение и накопление информации по данной проблеме является чрезвычайно актуальным, как для понимания фундаментальных аспектов патогенеза ХГС, так и для совершенствования методов его диагностики и лечения.

Связь работы с научными программами, планами, темами.Диссертационная работа выполнена согласно плана научно-исследовательских работ Винницкого национального медицинского университета им. М.И. Пирогова МЗ Украины и была фрагментом научной работы кафедры инфекционных болезней «Изучение взаимосвязи вирусных, метаболических и генетических факторов с особенностями течения хронических вирусных гепатитов В и С», № государственной регистрации 0104V003552. Диссертант был соисполнителем темы.

Цель исследования: определить клинико-патогенетические особенности течения хронического гепатита С при различных мутантных аллелей гена гемахроматоз на основе уточнения механизмов генетической детерминантности возникновения синдрома перегрузки железом.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

  1. Определить частоту мутантных аллелей гена гемохроматоза при ХГС.
  2. Оценить клинические особенности течения ХГС при наличии мутантных аллелей гена гемохроматоза.
  3.  Установить частоту развития синдрома перегрузки железом у больных ХГС и его связь с полиморфизмом гена гемохроматоза.
  4. Оценить степень развития гемосидероза при наличии мутантных аллелей гена гемохроматоза.
  5. Создание прогностической модели возникновения HFE-детерминированного синдрома перегрузки железом.

Объект исследования - синдром перегрузки железа у больных ХГС, полиморфизм гена HFE.

Предмет исследования - показатели цитолиза, холестаза, белково-синтетической функции печени, метаболизма железа, мутантные аллели гена HFE, морфологические изменения в печени у больных ХГС

Методы исследования: в работе использованы общеклинические, эпидемиологические, инструментальные, молекулярно-генетические, морфологические, биохимические, иммуноферментные методы исследования. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета программ SPSS 12 и Statistica 6.0, а также с применением логистической регрессии, нахождения параметров модели и тестирования гипотез относительно их свойств осуществлялось в среде пакета Mathcad 7.0 Professional

Научная новизна полученных результатов. Впервые на основе комплексного обследования определены особенности течения ХГС в зависимости от полиморфизма гена HFE, при этом установлена частота мутантных аллелей гена HFE у больных данной патологией.

Впервые определено, что наличие мутаций гена HFE сопровождается достоверным ростом показателей обмена железа по сравнению с общей группой больных ХГС. Больные ХГС с наличием мутаций имеют более тяжелое течение заболевания, что подтверждается более частым выявлением возросшего уровня ГГТ, ЛДГ, α -фетопротеина, пониженного уровня гемоглобина и тромбоцитопении, что является неблагоприятным фактором влияния на течение гепатита. У больных ХГС с наличием мутационных аллелей достоверно чаще выявлялся высокий уровень виремии — 71,9%, чем у больных с их отсутствии — 50,7%.

Наличие мутаций гена HFE сопровождается достоверным увеличением уровней показателей обмена железа по сравнению с общей группой больных ХГС. СПЗ проявляется в 47,75% больных ХГС при полиморфизме гена HFE, что может быть одним из факторов прогрессирования заболевания вследствие активации воспалительно-некротического повреждения печени.

Впервые оценены взаимосвязь степени морфологических изменений в печени у больных ХГС с СДР, показано наличие выраженного гемосидероза у подавляющего большинства пациентов с полиморфизмом гена HFE,  установлено наличие тенденции к повышению процента гемосидероза печени при росте интенсивности фибротичних изменений в органе.  Кроме того,  среди больных с наличием полиморфизма гена HFE была обнаружена достоверно большее количество лиц со значительными воспалительными изменениями в печени (А3) и выраженным фиброзом (F4).

С помощью логистической регрессии впервые проведен анализ роли различных факторов возможности возникновения детерминированного СПЗ, установлено влияние пола, возраста, вирусной нагрузки, наличии мутаций гена HFE на риск ГХС.

Практическое значение полученных результатов. Разработаны принципы оптимизации диагностики ХГС при полиморфизме гена HFE, которые заключаются в рациональном сочетании клинических, биохимических, морфологических т а генетических тестов.Предложено процесс обследования больных ХГС с СПЗ включать не только оценку вирусной нагрузки и определение генотипа вируса, но и исследование наличия мутантных аллелей гена HFE, которые наиболее адекватно отражают возможные морфологические изменения печени больных и влияют на течение заболевания. Проведенные исследования имеют большое значение для определения отдаленных последствий заболевания и его прогноза.

Процент верно классифицированных случаев в результате применения логистической модели прогнозирования наличия или отсутствия ГХС по известным значениям измерений составляет 85,4%, что подтверждает практическую эффективность применения модели, имеет низкую чувствительность и высокую специфичность.

Внедрение результатов исследований в практику.Результаты исследований внедрены в практику работы гастроэнтерологического отделения Винницкой областной клинической больницы им .. М.И. Пирогова, инфекционное отделение № 2 Винницкой городской клинической больницы № 1, инфекционное отделение Хмельникского районной больницы, отделениях Хмельницкой областной инфекционной больницы.

Научные разработки и результаты диссертации используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней Винницкого национального медицинского университета им. Н.И.Пирогова Минздрава Украины.

Личный вклад диссертанта.Автором самостоятельно проведен патентно-информационный поиск, анализ отечественной и зарубежной научной литературы по теме диссертации, определено направление научного исследования, сформулирована цель и задачи работы, разработана методология исследования, отобран комплекс биохимических и инструментальных методов обследования, осуществлен набор больных и их объективное обследование.

Непосредственно автором выполнены клинические наблюдения, проанализированы результаты клинико-лабораторных, инструментальных исследований, гистологических, статистических отчетов и медицинской документации.

Диссертантом лично проведена обработка полученных результатов, анализ и обобщение, сформулированы все положения, выводы и практические рекомендации, подготовлено к печати научные работы, доклады.

Апробация результатов диссертации.Основные положения диссертационной работы освещены  на: конференции общества инфекционистов Винницкой области «Современные проблемы инфекционных заболеваний у детей и взрослых» (Винница, 2005); конференции «Современные подходы к диагностике и лечению хронических вирусных гепатитов» (Одесса, 2008); научно-практическом семинаре «Актуальные вопросы лечения пациентов с хроническим вирусным гепатитом С» (Винница, 2008), научно-практической конференции и пленуме Ассоциации инфекционистов Украины «Инфекционные болезни в клинической и эпидемиологической практике» (Львов, 2009), научно-практической конференции « гастроэнтерология сегодня: успехи, проблемы и пути их решения (Днепропетровск, 2009).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 в профессиональных журналах, утвержденных ВАК Украины.

Объем и структура диссертации.Работа выполнена по общепринятой форме на 158 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», 3-х глав собственных исследований, анализа и обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, из них кириллицей — 38, латиницей — 191.Диссертация иллюстрирована 41 таблицей и 25 рисунками.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследования. Обследовано 101 больного ХГС, которые составили основную группу и находились на диспансерном учете в Винницком гепатологического центре в течение 2006-2008 гг Среди пациентов преобладали мужчины — 58,41% лиц, средний возраст которых составил 36,49 ± 9 , 95 лет.Все обследованные были лицами украинской национальности в третьем поколении, коренными жителям Винницкой области.В контрольную группу вошло 31 практически здоровый человек.По возрастному и половому принадлежностью сравниваемые группы были идентичны.Материалом для исследования были амбулаторные карты и истории болезней пациентов с ХГС.

Диагноз ХГС был выставлен согласно классификации, приведенной в МХБ-10, и подтвержден выявлением в сыворотке крови всех обследованных больных суммарных anti-HCV в течение шести месяцев, положительной ПЦР с определением наличия HCV-RNA, генотипирование HCV и исследованием вирусной нагрузки. У всех пациентов был обнаружен 1-й генотип вируса гепатита С.

У всех больных оценивались показатели основных биохимических синдромов — цитолиза, холестаза, печеночно-клеточной недостаточности. Оценка синдрома цитолиза включала в себя определение активности АЛТ, АСТ и ЛДГ унифицированными методами Райтмана-Френкеля. Оценка синдрома холестаза включала определение активности ГГТ и содержания билирубина и его фракций, которые определяли унифицированным методом Ендрасика-Грофа, содержанием щелочной фосфатазы. Оценка синдрома печеночно-клеточной недостаточности включала определение содержания общего белка (микробиуретовий метод), альбумина, холестерина и величину протромбинового индекса унифицированным методом Илька. Содержание α- фетопротеина для оценки риска возникновения ГЦК определяли методом ИФА с использованием стандартных наборов фирмы IMMUNOTECH, Франция. Исследования проводились в украинских лечебно-диагностическом центре (г. Киев).

Определялся развернутый общий анализ крови, включающий в себя содержание гемоглобина, количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, СОЭ, нейтрофилов, лимфоцитов, и гемостазиограма.Определение уровней сывороточного железа, ферритина и трансферрина выполнялось на модульно-аналитической системе закрытого типа Cobas (i 501, e601) с применением тест-систем производства Roche Diagnostics (Швейцария).Исследования проводились в лаборатории «Синев» (г. Киев).Ни один из больных перед обследованием не получал препараты железа, употреблял пищу накануне течение 12 часов.        

Кровь больных ХГС для исследования на наличие мутаций гена HFE добавлялась к раствору гемоконсерванты Глюгицир (фирма «Синтез», Россия) в соотношении 5:1.ДНК из образцов свежей крови выявляли согласно методу Венерта и соавтор.ПЦР проводили в автоматическом режиме на термоциклер Perkin Elmer (фирма Cetus, США) и амплификатора производства фирмы Биозон (Россия) по общему методом Saiki RK et al.Исследования проводились в лаборатории геномикы человека Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины (зав. лаб. Д.биол.н., проф. Лившиц Л.А.).

Для оценки гистологической картины поражения печени при ХГС определялись степень активности некрозозапального процесса и стадия фиброза путем проведения чрескожной пункционной биопсии печени (ПБП) иглами «UNICUT G16″ фирмы «Bard» (Германия) под УЗИ-контролем 46 больных.Материал фиксировали в 10% буферном растворе формалина.Использовали загальногистологични методики окраски: гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Для определения отложений гемосидерина применяли окрашивание Перлса.Оценку активности некроза-воспалительного процесса и стадии фиброза осуществляли по системе МETAVIR (Франция, 1994). Выраженность гемосидероза оценивалась полуколичественным методом: I степень гемосидерин определялся менее 25% гепатоцитов; II степень-в 25-50% печеночных клеток периферии долек; ИИИ степень гемосидерин определялся в 50-75% гепатоцитов, кроме центро-лобулярных; IV степень гемосидерин в большинстве клеток всех зон долек Исследования проводились на кафедре патологической анатомии Винницкого национального медицинского университета им.М.И.Пирогова.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета программ SPSS 12. (Лицензионный номер 9593869, принадлежит кафедре инфекционных болезней Винницкого национального медицинского университета им. Н.И. Пирогова МЗ Украины) и «STATISTICA 5,5» (принадлежит ЦНИТ им. Н.И. Пирогова, лицензионный № АХХR910A374605FA) и логистической регрессии. Оформление и печать работы выполнялись в текстовом редакторе Word (Вороненко Ю.В., Москаленко В.Ф., 2000).

Результаты и обсуждение

Среди всех обследованных больных ХГС мутантные аллели гена HFE были обнаружены у 32 (31,68%) пациентов. Среди них было 17 женщин и 15 мужчин, средний возраст которых составлял 36,87 ± 12,30 лет.

Наиболее часто у больных ХГС с наличием полиморфизма гена HFE оказывалась «мягкая» мутация H63D гена (рис. 1), которая была найдена в гетерозиготном состоянии в 68,75% случаев и только в 6,25% в гомозиготном.

М 1 2 3 4 5

Рис. 1. Определение мутации H63D методом ПЦР / ПДРФ.

Мажорная мутация гена HFE C282Y (рис. 2) встречалась гораздо реже, в гетерозиготном состоянии в 12,50% больных, а в гомозиготном только в 3,13% из обследованных больных (табл. 1). Трое больных ХГС (9,37%) были обнаружены как смешанные (компаунд) гетерозиготы C282Y + H63D гена HFE. Среди больных ХГС с наличием «мягкой» мутации H63D гена HFE в гетерозиготном состоянии было 54,55% мужчин и 45,45% женщин. В то же время среди гомозигот по этой мутации были только мужчины. Мажорная мутация C282Y в гетерозиготном варианте встречалась в 1 (25%) мужчины и в 3 (75%), женщин тогда как единственным гомозиготным носителем этой мутации была женщина. Женщины составляли также группу компаунд — гетерозигот (3 больных).

250 п.н.

139 п.н.

111 п.н.

Рис. 2. Определение мутации C282Y методом ПЦР / ПДРФ.

Наименьшее количество больных ХГС с полиморфизмом гена HFE была в возрастной группе до 19 лет. Таких пациентов выявлено лишь двое (6,25%). Количество больных с наличием мутаций в возрасте 20-29 лет составляла 6 человек, или 18,75% от общей группы.Только 4 (12,50%) пациенты с полиморфизмом гена HFE были в возрасте 40-49 лет. Наибольшее количество больных ХГС с наличием мутантного аллеля гена HFE была в возрастной группе 30-39 — 13 (40,63%) человек. Пациентов старше 50 лет среди пациентов с наличием мутаций было 7 (21,87%).

Нами не было выявлено достоверной разницы в частоте возникновения большинства основных клинических проявлений заболевания у больных в зависимости от наличия или отсутствия мутаций гена HFE. Такие клинические признаки астеновегетативного синдрома, как общая слабость наблюдалась в большинстве больных обеих групп, а именно в 26 (81,25%) пациентов с наличием мутаций и у 55 (79,71%) человек без мутаций. Несколько меньший процент больных в обеих группах предъявляли жалобы на повышенную утомляемость (65,63% и 66,67%, соответственно). Основным проявлением диспепсического синдрома у 19 (59,37%) обследованных больных с наличием мутационных аллелей и у 33 (47,83%) больных с отсутствием мутаций была тяжесть в правом подреберье.

Проявления геморрагического синдрома достоверно чаще, почти в два раза, наблюдались у больных с полиморфизмом гена HFE.Жалобы на это предъявляли 8 (25%) пациентов с мутациями на 7 (10,14%) лиц с нормальным генотипом. Еще более чувствительна разница была обнаружена в наличии зуда. Жалобы на это предъявляли в более восьми раз чаще больные х мутациями (9,37% против 1,44% соответственно). Пигментация кожи, не сопровождалась нарушениями в обмене билирубина, наблюдалась только у больных с мутаций гена HFE. Таких больных было 4 или 12,50% из пациентов данной группы.

При объективном обследовании гепатомегалия определялась у 28 (87,50%) больных с наличием мутационных аллелей, было достоверно в 1,5 раза чаще по сравнению с группой больных с нормальным генотипом, где этот показатель оказывался у 40 (57,97% ) больных. Число пациентов с увеличением селезенки, независимо от наличия или отсутствия мутаций по сравнению с подобным при увеличении печени, было меньше. Так, спленомегалия определялась в 8 (25%) человек с полиморфизмом гена HFE и у 13 (18,84%) с его отсутствием. Та же тенденция прослеживалась и при УЗ-исследовании.

Нами было установлено тенденцию к более частому выявлению большинства внепеченочных проявлений у пациентов с мутациями гена. А пациент с синдромом Рейно наблюдался только в группе с наличием мутантного аллеля. По сравнению с пациентами с нормальным генотипом достоверно чаще при наличии мутаций регистрировалась тромбоцитопения (11 больных — 15,94% против 16 — 50%, р <0,001).

Течение ХГС независимо от наличия или отсутствия мутаций сопровождался значительным ростом уровня сывороточных показателей цитолиза. Так, уровень АЛТ в сыворотке крови возрастал в 4,4 и 3,3 раза соответственно у больных с наличием и отсутствием мутаций. Рост уровней АСТ в сыворотке происходило в 4,9 раз у больных с мутантных аллелей и в 4,1 раза у пациентов с нормальным генотипом. Наименьшим был рост уровня ЛДГ, что в 2,7 и 2,6 раза повышалась у больных с мутаций и их отсутствием.

Уровень ТТГ в группе больных с наличием мутантного аллеля рос в 3,8 раза, что было достоверно больше чем в группе пациентов без мутаций, где данный показатель повышался в 3,3 раза. Еще больший рост наблюдался относительно уровня α- фетопротеина, что у больных с мутациями рос в 4,7 раза, у пациентов с нормальным генотипом в 4,3 раза.

Более половины больных с наличием мутаций наблюдалось снижение уровня гемоглобина, что в 3,8 раз превышало данный показатель в группе пациентов с нормальным генотипом. Подобная картина сохранялась относительно снижения уровня тромбоцитов, что в 3 раза чаще встречался у больных с мутантных аллелей. Уровень гемоглобина и количество эритроцитов снижался в 1,2 раза у пациентов с мутациями и 1,1 раз у лиц с нормальным генотипом. Еще большая разница была зафиксирована в снижении количества тромбоцитов, была в1, 6 раза ниже в группе пациентов с мутациями и в 1,3 раза в группе с отсутствием мутаций.

Подавляющее большинство больных с наличием мутаций достоверно (р = 0,0475) имела высокий уровень вирусной нагрузки — 71,88% больных, тогда как подобный показатель среди больных без мутаций составил 50,72% пациентов.

Анализ основных показателей обмена железа обнаружил их значительные изменения у больных ХГС. Так, уровень сывороточного железа у женщин и мужчин, которые имели клинико-лабораторные признаки хронического вирусного поражения печени, был выше в 1,3 раза по сравнению с аналогичными группами здоровых лиц. Еще более существенные изменения были обнаружены в уровнях ферритина.Независимо от пола больных наблюдалось значительное повышение уровня ферритина в сыворотке крови. Средний уровень сывороточного ферритина у женщин и у мужчин достоверно в 4,7 и 4 раза превышал соответствующие показатели среди здоровых.

Отклонение уровня железа от референтного интервала наблюдалось в 32,67% обследованных, а гиперферитинемия в 33,67% больных. Синдром перегрузки железом (одновременное выявление гиперферемии и гиперферитинемии) нами был обнаружен в 20,79% больных ХГС.

Проведенное нами сравнение показателей обмена железа в группах больных ХГС с наличием и отсутствием мутаций в гене HFE показало значительное достоверное преобладание (в 1,4-1,5 раза) уровней сывороточного железа и ферритина в группе. больных с выявленными мутантными аллелями гена HFE.

Было выявлено достоверное повышение уровня трансферрина в группе больных с наличием мутантного аллеля гена HFE, в которых данный показатель составлял 3,02 ±
0,37 г / л. У пациентов без мутаций трансферрин сыворотки крови определялся на уровне 2,77 ± 0,60 г / л.

Сопоставление частоты возникновения отклонений от референтного интервала контроля основных показателей ферокинетикы в группах больных ХГС с наличием или отсутствием полиморфизма гена HFE установило достоверную разницу уровня железа в зависимости от группы пациентов. Так, в 56,25% больных ХГС, которые имели мутации, наблюдалась гиперферемия, что было достоверно выше в группе обследованных с нормальным генотипом — 21,74%, соответственно. Гиперферитинемия была обнаружена в 43,75% пациентов и в 1,5 раза превышала данный показатель в группе обследованных с нормальным генотипом — 28,98%. Согласно нашим наблюдениям СПЗ был обнаружен в 43,75% больных ХГС с наличием мутаций в гене HFE, в то же время данный показатель в группе пациентов без мутаций составил лишь 10,14% (рис. 3).

Гистологическое исследование биоптатов печени всех больных ХГС показало, что у больных с отсутствием мутаций дистрофические и некротические изменения гепатоцитов по распространенности и глубиной отличались несколько меньшей интенсивностью по сравнению с изменениями в биоптатах больных ХГС с наличием мутаций. Что касается пролиферативных процессов в печени в группе больных с отсутствием мутаций, они были умеренными и заключались в неравномерной пролиферации звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (клеток Купфера), наличием двухъядерных гепатоцитов, как признаки регенерации.

В биоптатах печени 47,83% больных ХГС при гистохимическом исследовании были обнаружены признаки гемосидероза. Гранулы гемосидерина в подавляющем большинстве оказывались в гепатоцитах перипортального и лобулярной зон частиц, что соответствовало паренхиматозном типа гемосидероза. В группе больных с отсутствием мутаций признаки гемосидероза печени наблюдались у 29,63% человек. Депозиты железа в биоптатах печени этой группы больных выявлялись в виде едва заметных пылевидных включений в цитоплазме отдельных клеток печени на фоне признаков дистрофии, некроза, холестаза, а также в виде зерен в единичных синусоидальных клетках, макрофагах, эндотелиоцитах. Обращает на себя внимание то, что в гепатоцитах с признаками гидропической, жировой дистрофии и некроза скопления железа не выявлялись.

*

*

Примечание. * — Разница достоверна между группами больных с наличием и отсутствием мутаций.

Рис. 3. Показатели обмена железа у больных ХГС при полиморфизме гена гемохроматоза.

Среди больных ХГС с наличием мутантного аллеля гена HFE явления гемосидероза печени были выявлены у 73,68% человек. В биоптатах у пациентов с «мягкой» мутации Н63D гена HFE увеличение содержания депозитов железа было умеренным и наблюдалось в основном в гепатоцитах перипоральных зон долек а в центре, где имело место гидропическая дистрофия и некроз, реакцией Перлса железо почти не виявлялось.Натомисть в незначительном количестве в виде пылевидных включений депозиты железа накапливались в структурных элементах внеклеточного матрикса и в виде зерен в единичных макрофагах.

Особенно значительное накопление депозитов железа в печени наблюдалось у больных ХГС, которые были носителями «мажорной» мутации C282Y и в компаунд-гетерозигот. Эти изменения соответствовали IV степени гемосидероза. Гемосидерин проявлялся при ХГС в гепатоцитах и ретикулоендо-телиоцитах (клетках Купфера) в соотношении 1:1, но такие изменения выявлялись лишь на фоне очагов полнокровие и кровоизлияния и не были связаны со степенью перегрузки ткани железом, не зависели от наличия мутантных аллелей гена HFE.

У больных с наличием в биоптатах печени признаков гемосидероза наблюдались более выраженные фибротичних изменения. В ячейках ткани печени перегруженных железом постоянно оказывались признаки фиброза, иногда с нарушением структуры частиц. У больных с наличием мутаций, преимущественно «мажорной» С282Y и во всех компаунд-гетерозигот, результаты гистологического исследования характеризовались развитием Цирротические изменения с высокой и средней степенью активности. При этом перенасыщение гепатоцитов железом было неравномерным. Гепатоциты с крупными и мелкими гранулами интенсивной окраски определялись преимущественно в перипоральных зонах псевдочасточок, а в центре, где проходила активная пролиферация, реакция Перлса была отрицательной, или наблюдались единичные мелкие зерна. В одном случае у больного ХГС, гетерозиготы по м которой мутацией на фоне Цирротические изменения в печени и признаков IV степени гемосидероза цитологическое была обнаружена гепатоцеллюлярная карцинома.

Наибольший процент лиц с воспалительными изменениями, которые отвечали А1 был зарегистрирован у больных без мутаций (33,33%), что вдвое превышало данный показатель среди больных с наличием мутационных аллелей — 15,79%. В то же время, изменения, которые отвечали степени активности воспаления А3, были обнаружены лишь при исследовании биоптатов печени больных ХГС с наличием полиморфизма гена HFE. Последних было 15,79% из обследованных с наличием мутаций.

Отсутствие признаков фиброза печени (F0) наблюдалось только у больных без мутаций — 11,11% человек. Морфологическая картина цирроза печени (F4) наблюдалась достоверно в четыре раза чаще среди больных ХГС с наличием мутационных аллелей гена HFE (42,10%) по сравнению с группой пациентов без мутаций (11,11%).

Установлено наличие тенденции к повышению процента гемосидероза печени при росте интенсивности фибротичних изменений в органе. Так, у больных ХГС без фибротичних изменений отсутствовали признаки гемосидероза. При наличии фиброза F3 гемосидероз наблюдалась у всех больных с мутациями гена HFE и в 37,50% пациентов с их отсутствием. У этой группы больных морфологические признаки перегрузки железом ткани печени соответствовали II-III степени гемосидероза. В биоптатах печени всех больных с Цирротические изменения были обнаружены гемосидероз. Однако, у больных с полиморфизма гена HFE данный признак соответствовала IV степени гемосидероза, в то же время, как среди больных с отсутствием мутаций этот показатель составлял лишь 33,33%. В целом у больных ХГС с наличием мутантных аллелей гена HFE гемосидероз III-IV степеней регистрировался в 52,63% из обследованных, тогда как у пациентов без мутаций только в 18,52% случаев.

Использование логистической регрессии при определении роли различных факторов в формировании гемохроматоздетермінованого синдрома (ГХС)  установило, что существенно (p <0,05) влияли на риск наличия ГХС следующие  предикторы: пол, возраст, вирусная нагрузка, наличие мутаций гена HFE. Наиболее существенно повышал риск возникновения ГХС наличие мутаций (р = 0,0026). Bик в сокращенной модели имел несомненную достоверность p = 0,0193.  Следует заметить, что большие значения этих предикторов повышали риск наличия ГХС (все соответствующие коэффициенты положительные). У женщин риск возникновения ГХС при равных других условиях был достоверно выше, чем у мужчин.

Женский пол пациента обуславливала практически 4-кратный риск по сравнению с мужчинами наличии ГХС при условии контроля влияния всех остальных факторов (СШ = 4,211 с 95% интервалом доверия от 1,185 до 14,960).

Каждый дополнительный год возраста (можно рассматривать как каждый дополнительный год экспозиций к факторам риска наряду с биологическим эффектом) увеличивал вероятность наличия ГХС в 1,062 раз при условии контроля влияния всех остальных факторов (СШ = 1,062 с 95% интервалом доверия от 1,010 до 1,118).

Пациенты с высокой вирусной нагрузкой имели в 5,792 выше шансы наличии ГХС (СШ = 5,792 с 95% интервалом доверия от 1,415 до 23,718). Пациенты с наличием мутаций имели в 6,466 выше шансы наличии ГХС (СШ = 6,466 с 95% интервалом доверия от 1,919 до 21,790).

Оценка прогностической мощности модели установила, что процент верно классифицированных случаев в результате применения логистической модели прогнозирования наличия / отсутствия ГХС по известным значениям измерений составляет 85,4%, что подтверждает практическую эффективность применения модели. Коэффициент ассоциации Сомеро утверждает наличие сильного прямой корреляционной связи (0,709). Полученные нами данные свидетельствовали о хорошие характеристики чувствительности и специфичности модели, доводило ее эффективность для практического использования. Чувствительность использовалась как статистический индекс прогностической точности модели и означала свойство модели верно идентифицировать пациентов с ГХС. Так, на пороговом уровне 0,5 33,3% чувствительность означает, что 43,3% пациентов с ГХС будут выявлены модели, а 56,7% случаев патологии будут пропущены.Специфичность означала способность модели правильно идентифицировать пациентов, у которых не имеет ГХС, то есть получить «верно-отрицательные» результаты. Так, на пороговом уровне 0,5 89,9% специфичность прогноза означает, что 89,9% пациентов без патологии по результатам прогноза будут идентифицированы как «негативные», и только 10,1% будут ошибочно идентифицированы как пациенты с ГХС.

Относительно низкая чувствительность и высокая специфичность модели указывала на целесообразность комбинации с предыдущим тестом, имела высокую чувствительность. Следовательно, область применения модели — отсев ложно-положительных, выявленных на первом шаге скрининга тестом с высокой чувствительностью или отсев «не-случаев» из групп риска. То есть, проведенный нами с помощью логистической регрессии анализ роли различных факторов в возможности возникновения детерминированного синдрома перегрузки железом, установил, что существенное влияние на риск наличия ГХС имели такие предикторы, как пол, возраст, вирусная нагрузка, наличие мутаций гена гемохроматоза.

Процент верно классифицированных случаев в результате применения логистической модели прогнозирования наличия / отсутствия ГХС по известным значениям измерений составляет 85,4%, что подтверждает практическую эффективность применения модели, имеет низкую чувствительность и высокую специфичность.

ВЫВОДЫ

В диссертации определены особенности течения ХГС у больных при наличии мутантных аллелей гена гемохроматоза, характер изменений биохимических показателей активности воспалительного процесса и степень фибротичних изменений в печени. С привлечением комплекса биохимических, генетических и морфологических решена задача усовершенствования диагностики синдрома перегрузки железом путем установления его взаимосвязи с полиморфизмом гена гемохроматоза.

  1. Проведенное исследование установило, что среди обследованных больных ХГС у 31,68% оказываются мутантные аллели гена гемохроматоза с преобладанием мутации H63D. У больных с наличием мутаций чаще наблюдался более тяжелое течение заболевания, с зудом и пигментацией кожи, геморрагическим синдромом, гепатомегалией, значительно возросшим уровнем ГГТ, ЛДГ, фетопротеина, пониженным содержанием гемоглобина и тромбоцитов. Кроме того, наличие мутантных аллелей сопровождалась высоким уровнем виремии (в 71,88% пациентов) по сравнению с количеством больных при их отсутствии (50,72%).
  2. Наличие мутаций гена гемохроматоза сопровождается достоверным увеличением уровней показателей обмена железа по сравнению с общей группой больных ХГС. Синдром перегрузки железом проявляется в 47,75% больных ХГС при полиморфизме гена гемохроматоза, что может быть одним из факторов прогрессирования заболевания вследствие активации воспалительно-некротического повреждения печени.
  3. В биоптатах печени у всех больных ХГС независимо от наличия или отсутствия мутантного аллеля гена гемохроматоза оказывались гистологические признаки HCV-инфекции. В то же время среди больных с наличием полиморфизма гена гемохроматоза наблюдалась большее количество лиц со значительными воспалительными изменениями в печени (А3) и выраженным фиброзом (F4)
  4. У больных ХГС с наличием мутантных аллелей гена гемохроматоза происходит существенное накопление гемосидерина, при этом гемосидероз III-IV степеней регистрировался в 52,63% из обследованных, тогда как у пациентов без мутаций только в 18,52% случаев. Гранулы гемосидерина преимущественно оказывались в гепатоцитах перипортального и лобулярной зон долек. Вместе с тем, было установлено наличие тенденции к повышению процента гемосидероза печени при росте интенсивности фибротичних изменений в органе, что может свидетельствовать о негативном влиянии гемосидероза на течение и исходы заболевания.
  5. Анализ роли различных факторов в возможности возникновения синдрома перегрузки железом путем логистической регрессии установил, что наиболее значительное влияние на риск наличия ГХС имеют пол, возраст, вирусная нагрузка, наличие мутаций гена гемохроматоза. Процент верно классифицированных случаев в результате применения логистической модели прогнозирования наличия или отсутствия ГХС по известным значениям измерений составляет 85,40%, что подтверждает практическую эффективность применения модели с низкой чувствительностью и высокой специфичностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. В практической деятельности врача-инфекциониста и гастроэнтеролога следует учитывать, что ХГС может сопровождаться синдромом перегрузки железом, который у части больных обусловлен наличием мутантных аллелей гена гемохроматоза. При этом заболевание имеет более сложный ход, часто с высокой вирусной нагрузкой, наличием высокой активности и выраженных фиброза и гемосидероза в ткани печени.
  2. Комплекс лабораторных тестов у больных ХГС должен включать определение содержания железа и ферритина в сыворотке крови в качестве маркеров синдрома перегрузки железом, в случае диагностики которого следует проводить генетическое исследование с целью определения мутантных аллелей гена гемахроматоз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Мороз Л. В. Полиморфизм гена гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С / Л. В. Мороз, В. М. Дудник, О.Ф.Турский, Л. А. Лившиц, В. М. Пампуха / / Современная гастроэнтерология. - 2009. - № 2 (46). - С. 26-29 ( Личный вклад — диссертантом изучены данные современной мировой литературы, осуществлен поиск литературных источников. Подготовка работы к печати).
  2. Мороз Л. В.Показникы ферокинетикы у больных хроническим гепатитом С / Л. В. Мороз, О.Ф. Турский, Д. П. Ипатова / / Актуальные вопросы фармацевтической и медицинской науки и практики. - 2009. - Т. 1. - С. 97-98 ( Личный вклад — собрание материала по данной теме, статистическая обработка динамики изменений показателей ферокинетикы).
  3. Мороз Л.В. Мутации гена гемохроматоза и особенности обмена железа у больных хроническим гепатитом С / Л. В. Мороз, В. М. Дудник, А. Ф. Турский / / Гепатология. - 2010. - № 1 (7). - С. 54-58 ( Личный вклад — поиск литературы, обработки и обобщения результатов, статистическая обработка полученных результате. подготовка работы к печати).
  4. Мороз Л.В. Гемосидероз печени у больных хроническим гепатитом С /
    Л. В. Мороз, А. Ф. Турский, А. Олипер, Д. П. Ипатова / / Вестник морфологии. - 2009. - № 15 (1). - С. 107-110 ( Личный вклад — собрание материала по данной теме. Подготовка работы к печати).
  5. Мороз Л. В. Показатели ферокинетикы у больных хроническим гепатитом С / Л. В. Мороз, А. Ф. Турский, Д. П. Ипатова / / Новости медицины и фармации. - 2009. - № 281. - С. 21-22. ( Личный вклад — статистическая обработка полученных результатов. Подготовка работы к печати).
  6. Мороз Л. В. Полиморфизм гена гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С / Л. В. Мороз, А. Ф. Турский / / Инфекционные болезни в клинической и эпидемиологической практике: материалы научно-практической. конф., 21-22 тр. 2009 г.: тезисы доп. - Львов, 2009. - С. 28-29. ( Личный вклад — собрание материала по данной теме, обработки и обобщения результатов обследования больных, подготовка статьи к печати).

 

Дополнительные статьи из рубрики "Инфекционные болезни"